薛林涛，王世凯，毛显宝，李正大，黄岳岳，张晓辉，魏平川，陈良士，谭伟红。
作者隶属关系[s].
广西壮族自治区人民医院生殖医学与遗传学中心，南宁，530021。
谭伟宏，电子邮件：ltxgxh 163.com，电话：+86-771-2186483
本文发表于《中国生殖与避孕杂志》。
2020,40[11]:887-892.
目的 开发一种技术系统，能够通过单精子卵质内显微注射（ICSI）早期检测卵细胞受精失败，然后早期进行人工激活。
方法 首先，我们回顾性地分析了2017年1月至2018年3月在广西壮族自治区人民医院生殖医学与遗传中心用延时胚胎动态监测系统培养的150个ICSI卵子的第二极释放时间（Pb2）的分布及其与受精和胚胎发育结果的关系。研究了Pb2释放作为ICSI受精失败早期指标的可行性。其次，一项随机对照试验收集了2018年3月至2019年6月期间93个ICSI辅助受孕周期的225个受精失败的卵母细胞，根据人工激活方式分为非激活组（NAOA组）、早期激活组（RAOA组）和后期激活组（LAOA组）。而其余的ICSI注射的卵母细胞作为对照，比较四组的受精率和 剩余的ICSI注射的卵母细胞作为对照，比较四组的受精率和胚胎发育参数，研究早期人工激活在ICSI受精失败中的效率和价值。
经过延时监测，有Pb2释放（0.03%，0.00%）组的受精率（99.91%）和双原生质体（2PN）受精率（97.76%）都明显高于无Pb2释放组（P<0.001）。Pb2释放时间的分布和百分比为0-3小时（58.58%），3-5小时（36.29%），5-8小时（3.92%），>8小时（1.21%）。NAOA组的Pb2释放率、受精率和2PN受精率为0%，LAOA组的2PN受精率（36.00%），第3天（D3）优质胚胎率（8.00%）。第5天（D5）囊胚转化率（0%）和D5质量囊胚转化率（0%）均明显低于RAOA组（60.00%、44.19%、51.16%、25.58%），差异有统计学意义（P=0.005、P=0.002、P& lt; 0.001，P=0.005），而都明显低于对照组（97.63%，48.62%，63.23%，37.94%），所有差异都有统计学意义（P都<0.001）。RAOA组的Pb2释放率（84.00%）、受精率（81.33%）、2PN受精率（60.00%）和2PN卵子发生率（95.56%）均明显低于对照组（100.00%、99.68%、97.63%、99.51%），差异均有统计学意义（P&。 lt;0.001，P<0.001，P<0.001，P=0.04），但两组之间的D3优质胚胎率、D5囊胚转化率和D5优质囊胚转化率没有统计学意义（均为P>0.05）。
结论：对Pb2释放的时间推移监测可作为ICSI卵子受精失败的早期指标，在ICSI注射5小时后对受精失败的卵子进行早期人工激活可能会导致正常受精和理想的胚胎发育。
延时成像；受精；极体；胞质内单精子注射；人工激活
基础项目：广西卫计委科研项目（Z2015305）；南宁市青秀县重点研发计划（2018025）。
卵胞浆内单精子注射（ICSI）通过人工将精子注入透明带，在很大程度上解决了因精子质量差或受精障碍导致精子无法穿过透明带的患者的精卵结合问题，但仍有近20%的临床治疗中 然而，近20%的成熟卵子即使在精子注射后也无法正常受精。人工辅助激活可以成功地诱导卵母细胞的Ca2+振荡，以启动第二次减数分裂并完成受精[2]。在这项研究中，我们首先分析了第二极体（Pb2）的释放和受精以及ICSI注射后胚胎发育的结果之间的关系，通过回顾性地分析用延时胚胎监测系统培养的ICSI周期中胚胎发育的动态参数。随机对照试验的结果被用来分析不同的人工激活方法对受精卵母细胞的激活效率和胚胎发育结果的影响，并研究对受精ICSI卵母细胞引进早期人工激活（RAOA）系统的可行性和价值。对这一系统的可行性和应用进行了调查。
2）组别划分：根据在延时摄影中是否观察到Pb2释放，将各组分为有Pb2释放和无Pb2释放的组别，并比较两组的受精参数。卵母细胞激活的随机对照试验通过简单的随机化分为几组，并根据人工激活方法细分为未激活组（NAOA组）、早期激活组（RAOA组）和晚期激活组（LAOA组），其中NAOA组的卵母细胞未被人工激活，直接转移到培养液中进行进一步培养。LAOA组在ICSI注射20小时后进行人工激活，其余ICSI注射的卵母细胞作为对照组，比较四组的受精和胚胎发育参数。
延时培养和Pb2监测：注射ICSI后，将卵母细胞转移到Primo Vision盘（16606，Vitrolife，丹麦）中的胚胎培养液中，在37℃和6%的CO2补偿下过夜，并放置在Primo Vision（Primo Vision Evo，匈牙利）。Primo Vision延时系统被安装在孵化器中，并与图像分析软件Analyzer连接。采集间隔的频率为10分钟，采样间隔的频率为60分钟，共7个均匀分布的焦平面。对Pb2的释放和胚胎发育进行了监测，从细胞质中释放出的极体可以清楚地观察到Pb2的释放，所有动态发育参数的时间都由两名有经验的技术人员进行验证。
4.人工激活卵母细胞。将失败的卵母细胞转移到准备好的含有50μl受精液（G-IVFplus，Vitrolife，瑞典）的微滴中，其中含有10μmol/L的离子霉素（每个微滴中有1个卵子），并在37℃、6%CO2、5%O2的培养箱中激活10分钟。1plus, Vitrolife, Sweden），将微滴洗净并转移到Primo Vision盘中进一步孵化。
6. 统计方法。采用SPSS19.0统计软件进行数据分析。符合正态分布的计量数据以均数±标准差（mean±SD）表示，组间比较采用独立样本t检验；计数数据以率（%）表示，组间比较采用χ2检验；P<0.05为差异有统计学意义。
2.Pb2释放与ICSI受精结果的关系：ICSI注射延时监测后，有Pb2释放的卵子受精率和2PN受精率分别为99.91%和97.76%，均高于无Pb2释放组（0.03%和0%），组间差异有统计学意义（P<0.001）。
3.Pb2释放时间的分布和比例：延时监测到ICSI注射后卵子的Pb2释放时间为（3.04±1.45）h。Pb2释放时间的分布和比例分别为0-3小时（58.58%）、3-5小时（36.29%）、5-8小时（3.92%）、>8小时（1.21%）。
4. Pb2释放时间与受精和胚胎发育结果之间的关系。在不同Pb2释放时间的组间，受精率、2PN受精率和第3天（D3）优质胚胎率没有统计学上的显著差异（所有P> 0.05）；5~8小时和>8小时组的2PN卵裂率低于0~3小时和3~5小时组，但只有5~8小时组与0~3小时和3~5小时组有统计学差异（P=0.002，P=0.003）。8小时组的D5囊胚转化率低于0~3小时、3~5小时和5~8小时组，差异有统计学意义（P<0.001、P=0.003、P=0.024）；0~3小时组的D5优质囊胚转化率高于3~5小时组。0~3小时组的囊胚转化率高于3~5小时和>8小时组，差异有统计学意义（P=0.008，P=0.049）（表1）。
5. 不同的人工激活方法对受精和胚胎发育结果的影响。NAOA组的Pb2释放率、受精率和2PN受精率均为0%，与其他三组的差异有统计学意义（P<0.001）；LAOA组的受精率低于RAOA组和对照组，但与对照组的差异只有统计学意义（P< 0.001）在LAOA组，2PN的受精率、D3质量的胚胎率、第5天（D5）的囊胚转化率和D5质量的囊胚转化率都明显低于RAOA组，差异有统计学意义（P=0.005，P=0.002，P& lt;0.001，P=0.005），而它们都明显低于对照组，且差异有统计学意义（P<0.001）。P<0.001）；只有RAOA组的Pb2释放率、受精率、2PN受精率和2PN卵子发生率明显低于对照组，且差异有统计学意义（P< 0.001，P<0.001，P<0.001，P=0.04），D3优质胚胎率、D5囊胚率转化率和D5优质囊胚转化率在组间没有统计学意义（P>0.05）（表2）。
正常受精的生理基础是精子通过透明带融合到卵母细胞的细胞质中，并由精子诱导卵母细胞的Ca2+振荡[3]。根据中华医学会生殖医学分会辅助生殖技术数据报告系统，2016年中国ICSI周期的2PN受精率为76.45%[4]，在完成精子注射后仍有约20%的成熟卵子没有受精，而临床数据显示，1%至5%的ICSI周期完全受精失败[5]。研究已经证实，卵细胞激活受损是导致ICSI周期受精失败的最重要因素。因此，研究ICSI受精在失败RAOA中的效率和应用是提高卵母细胞利用率的有效途径。
准确判断受精失败是ICSI辅助激活受精卵细胞的先决条件。Pb2的释放和雌雄原核的形成是正常受精过程中两个最重要的生理事件，也是受精的两个重要形态标志。Pb2的释放是早期受精的一个有价值的形态学预测指标，已被证实并用于IVF受精失败的ICSI治疗中[6]。然而，值得注意的是，RICSI是一个更好的受精的形态学预测器。然而，应该注意的是，RICSI中Pb2的测定大多是在固定的时间点通过倒置显微镜观察完成的，而Pb2的释放是一个动态过程，一定比例的卵母细胞会出现Pb2部分破碎或接近Pb1的形态特征，这很容易导致误解。Lapse技术可以实时跟踪胚胎在体外的动态发展，在观察和分析受精和胚胎发育过程中的形态生理事件方面具有独特的能力[7]。在这项研究中，延时技术可以用来实时跟踪极体从卵母细胞的细胞质中释放到细胞周围空间的动态生理过程，克服了静态图像观察的缺点，可以准确测定Pb2的释放。不释放Pb2的鸡蛋受精率只有0.03%，2PN的受精率为0%。这证实了Pb2的释放是正常受精的一个必要生理过程，对Pb2释放的延时监测可作为受精失败的早期指标。
早期受精失败后人工辅助激活的时间对激活的效率有直接影响。在自然生理状态下，细胞内的Ca2+振荡在精子与卵子融合的几分钟内被触发。然而，如果精子或卵子功能障碍不能触发胞质内Ca2+释放，受精就可能失败。临床研究表明，在微注射精子后用Ca2+载体人工激活卵母细胞以诱导内源性Ca2+振荡，也可以重新启动减数第二次分裂以完成受精。一些研究表明，ICSI后18-72小时，卵母细胞仍可被外源性Ca2+载体激活，并可形成正常的受精卵母细胞，但由于老化的卵母细胞胚胎发育结果不佳[10-11]，在准确判断受精失败的基础上及早进行人工辅助激活，可能有助于使ICSI受精失败的卵母细胞早日康复。本研究结果显示，ICSI周期中Pb2的释放时间为（3.04±1.45）h，这与Liu的研究结果一致。这与Liu等人[12]的结果一致，其中94.87%的卵母细胞在精子注入后5小时内释放了Pb2，而且释放Pb2的时间与随后的受精和胚胎发育结果之间存在着关联。本研究结果显示，5小时RAOA组和20小时LAOA组的卵母细胞激活率明显高于NAOA组，这也证实了人工辅助激活ICSI受精失败的卵母细胞可以激活卵母细胞。在胚胎发育的参数中也观察到同样的趋势，20小时LAOA组的胚胎发育非常差，特别是在囊胚形成方面。此外，本研究表明，虽然通过早期愈合激活实现了60%的正常受精率，但与ICSI后正常释放Pb2的卵母细胞相比，存在明显的差异，胚胎发育的所有参数也都有所下降。尽管本研究的结果显示，早期人工激活可以使体外胚胎具有正常的形态学评估，但在分子水平上对其安全性的评估，如染色体状态和甲基化变化，应进一步探讨。
此外，本研究中发现的ICSI受精失败的卵母细胞的早期激活，不仅对d